replikacji zrekombinowanego DNA do czasu, gdy będzie można prawidłowo ocenić ryzyko. Ponownie podjął badania w roku 1976, kiedy to na konferencji w Asilomar naszkicowano dokładne protokoły bezpieczeństwa dla dalszych badań (zob. ramka). Podobne zagadnienia stale i nieodłącznie wiążą się z inżynierią genetyczną; chociaż tysiące rekombinowanych produktów używano bezpiecznie w ostatnich trzech dziesięcioleciach, wielu krytyków wciąż apeluje o większą ostrożność.
Odwrotna transkryptaza
Innym enzymem, który okazał się ważny w badaniach genetycznych, jest odwrotna transkryptaza odkryta przez Davida Baltimore’a i Howarda Temina w 1970 roku. Wykorzystywana jest przez wirusy takie jak HIV do transkrypcji ich RNA na DNA i wstawienia go do komórki, gdzie może ulec replikacji. Wiele leków na HIV i inne wirusy działa przez hamowanie odwrotnej transkryptazy. Enzym pozwala także na zmianę informacyjnego RNA na DNA w laboratorium. Może to być użytecznym narzędziem do wychwytywania genów, pozwalając naukowcom na znajdowanie transkrybowanych mRNA i wykorzystywanie ich do odtwarzania sekwencji DNA, z których pochodziły.
Pierwsze organizmy modyfikowane genetycznie Mniej tchórzliwi lub bardziej beztroscy, zależnie od punktu widzenia, byli Herbert Boyer z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco i Stanley Cohen z Uniwersytetu Stanforda. W momencie stworzenia zespołu Boyer badał enzymy restrykcyjne, a Cohen plazmidy – koliste fragmenty DNA znajdowane u bakterii, które czasem wymieniają je między sobą, co stanowi mechanizm obronny przeciw antybiotykom i fagom. Boyer i Cohen wykorzystali nowe narzędzia inżynierii genetycznej, aby dodać geny odpowiedzialne za oporność na antybiotyki do plazmidu, a następnie wprowadzić do E. coli. Bakterie uzyskały oporność na antybiotyk. Były pierwszymi organizmami modyfikowanymi genetycznie (genetically modified organism, GMO).
Pierwszym zastosowaniem rekombinowanego DNA w laboratorium było „klonowanie” interesujących genów przez wycinanie ich i wstawianie do plazmidów. Umieszczone w bakteriach plazmidy ulegały replikacji, tworząc liczne kopie genów nadające się do badania przez naukowców. Warianty tej procedury zastosowano do klonowania segmentów DNA człowieka, które mapowano w Projekcie Genomu Człowieka (zob. rozdz. 12).
Wciąż bardziej ekscytujące – i bardziej atrakcyjne finansowo – były potencjalne zastosowania medyczne. Boyer zauważył, że jeśli wprowadzi się ludzkie geny do plazmidu, możliwe będzie skłonienie bakterii do wytwarzania białek ludzkich, które następnie można użyć do leczenia. W 1976 roku założył przedsiębiorstwo Genentech zajmujące się komercjalizacją technologii, korzystając ze wsparcia finansowego Roberta Swansona na zasadzie venture capital.
Konferencja w Asilomar
W 1975 roku Paul Berg zgromadził 140 naukowców, lekarzy i prawników w centrum konferencyjnym Asilomar State Beach, aby przedyskutować kwestie etyczne związane z inżynierią genetyczną. Stworzyli oni wiele zasad bezpieczeństwa biologicznego mających na celu zapobieganie przypadkowemu uwolnieniu organizmów rekombinowanych, które mogłyby infekować ludzi czy zwierzęta. Głównym zaleceniem było, aby podczas badania wirusów ludzkich lub zwierzęcych wykorzystywać jako gospodarzy bakterie niezdolne do przeżycia poza laboratorium. W ten sposób minimalizuje się ryzyko nieprzewidzianej ucieczki „rozrabiaki”.
Pierwszym sukcesem przedsiębiorstwa była rekombinowana wersja insuliny (hormonu niezbędnego do metabolizmu cukru, którego brakuje pacjentom z cukrzycą typu I), którą wcześniej uzyskiwano ze świń. Boyer stworzył ją poprzez wstawienie genu kodującego ludzką insulinę do E. coli za pomocą plazmidu. Bakteria, która pobrała plazmid, stała się fabryką insuliny, wytwarzając ogromne ilości hormonu nadające się do użytku medycznego.
Podobne podejście obecnie wykorzystuje się do tworzenia mnóstwa leków i innych produktów komercyjnych, z których wiele jest korzystniejszych niż wcześniej stosowane. Na przykład ludzki hormon wzrostu do leczenia karłowatości ekstrahowano kiedyś z przysadek mózgowych zmarłych i z powodu zanieczyszczeń zarażono wielu przyjmujących chorobą Creutzfeldta–Jakoba – ludzkim odpowiednikiem choroby wściekłych krów. Wersja zrekombinowana nie niesie takiego ryzyka. Istnieje nawet zrekombinowana forma podpuszczki do robienia wegetariańskiego sera – prawdziwą uzyskuje się z krowich żołądków. Muller miał rację – mutacje można zaprząc do własnych celów.
‘ Zmartwienie, że DNA wędrujący między gatunkami naruszy istniejące
bariery reprodukcyjne i wywrze duży wpływ na naturalne procesy ewolucyjne, w znacznym stopniu znikło, gdy badania naukowe ujawniły, że taka wymiana zachodzi w naturze. ’
Paul Berg
MYŚL W PIGUŁCE
Genami można manipulować
Fred Sanger: „Temat ten [sekwencjonowanie] był w centrum moich badań od 1943 roku, zarówno ze względu na moją własną fascynację, jak i przekonanie, że znajomość sekwencji może dużo wnieść do naszej wiedzy o materii ożywionej”.
LINIA CZASU
1972
Walter Fiers (ur. 1931) ustala pierwszą sekwencję genu
1975
Fred Sanger (ur. 1918) tworzy technikę sekwencjonowania przez terminację łańcucha
1977
Sanger sekwencjonuje pierwszy cały genom organizmu, bakteriofaga Phi-X174
1981
Zespół Sangera sekwencjonuje ludzki genom mitochondrialny
1991
Craig Venter (ur. 1946) rozwija nową metodę szybkiego wychwytywania genów z wykorzystaniem znaczników ekspresji
Do początku lat 70. XX wieku nauka poznała strukturę DNA będącą podwójną helisą, tryplety, za pomocą których koduje białka, wiele sekwencji aminokwasów, z których zbudowane są te komórkowe konie robocze. Hamilton Smith, Paul Berg i Herbert Boyer także podjęli pierwsze kroki w inżynierii genetycznej, ustalając, w jaki sposób można przenosić proste fragmenty DNA z jednego organizmu do drugiego.
Dalszy postęp w poznawaniu genetyki i jej wykorzystaniu w medycynie, wciąż był jednak hamowany przez istotną barierę techniczną. Niezmiernie trudno było wywnioskować, które fragmenty DNA są konkretnymi genami i jaki jest porządek „liter” DNA, którymi są zapisane.
Pierwszy gen wyizolował z bakterii amerykański genetyk Jonathan Beckwith w 1969 roku, a pierwszą sekwencje genu kodującego białko płaszcza wirusa ustalił belgijski biolog molekularny Walter Fiers w 1972 roku. Osiągnięcia te jednak opierały się na odczytywaniu kopii RNA informacji genetycznej, nie samego DNA. Technika była powolna i mało wydajna, a ponieważ RNA żyje krótko, nadawała się jedynie do małych genów. Nie istniał sposób rutynowego czytania porządku zasad DNA, a zatem nie istniały szanse na mapowanie bardziej złożonych genów, nie mówiąc o sekwencji całego genomu dużych organizmów.
Świetną metodę sekwencjonowania wynalazł wreszcie w 1975 roku Fred Sanger, brytyjski biochemik, który już wcześniej zdobył Nagrodę Nobla za ustalenie sekwencji aminokwasowej insuliny. Metoda odmieniła oblicze biologii, zmieniając perspektywy poznawania i manipulacji funkcją genów i ostatecznie umożliwiając naukowcom zmapowanie sekwencji genetycznej człowieka.
Sekwencjonowanie genomu Nowatorskie podejście Sangera wykorzystywało jedną nić DNA jako matrycę dla czterech eksperymentów, w oddzielnych probówkach. W każdej umieścił zupę z czterech zasad A, C, G iT–i polimerazę DNA, enzym, który je wykorzystuje do stworzenia nowej komplementarnej nici. Do każdego doświadczenia następnie dodawany jest „magiczny składnik” – zmodyfikowana wersja jednej z zasad, która zatrzymuje reakcję, jak tylko zostanie wykorzystana w nici i zaznacza jej koniec znacznikiem radioaktywnym.