Независимо от того, чей геном мы хотим отредактировать: хомяка или человека, комара или мыши, красной смородины или красного дерева, – процесс остается по сути одним и тем же. Это связано с тем, что все организмы в природе используют один и тот же универсальный код ДНК, состоящий из одного и того же четырехбуквенного алфавита.
В своем естественном состоянии Cas9 не интересуется ДНК, в основном случайно сталкиваясь и отскакивая от нее. Но как только Cas9, имеющая форму ладони, захватывает направляющую РНК, точная реконфигурация структуры белка заставляет ее взаимодействовать с ДНК в поисках подходящей мишени. По словам Блейка Виденхефта, профессора Университета штата Монтана, белковые комплексы Cas «патрулируют все внутриклеточное пространство, находят чужеродную [вирусную] ДНК, связываются с ней и приговаривают ее к уничтожению в считаные минуты… это довольно впечатляющий процесс»[71].
Поиск и связывание с целевой последовательностью происходят в два этапа. Прежде всего Cas9 ищет короткий мотив ДНК, называемый последовательностью PAM[72], – маяк, который дает ферменту сигнал для кратковременного связывания с ДНК, и взаимодействует с ним. «Это мимолетное взаимодействие приводит к искривлению ДНК», – объясняет Виденхефт. Изгибая ДНК, Cas9 расцепляет нити двойной спирали, чтобы направляющая РНК могла проскользнуть в образовавшуюся щель (создавая так называемую R-петлю)[73]. Направляющая РНК быстро сверяет последовательность с текстом целевой ДНК. Если будет найдено идеальное совпадение среди всех двадцати оснований (букв текста), то ДНК-последовательность будет уничтожена. Cas9 рассекает[74] обе нити ДНК так же ровно, как кухонный нож, создавая двухцепочечный разрыв (DSB, double-strand break) всего в нескольких основаниях от последовательности PAM[75].
Этот удивительный процесс был потрясающе снят на видео исследователями Токийского университета Хироси Нисимасу и Осаму Нуреки в 2017 г. Используя метод, называемый высокоскоростной атомно-силовой микроскопией, они смогли увеличить изображение в тот самый момент, когда Cas9 захватывала молекулу ДНК. В фильме Cas9 выглядит как позолоченный камень, когда она останавливается на несколько секунд на нити ДНК, прежде чем разрубить ее пополам[76]. После того как Нисимасу выложил это видео в своем аккаунте Twitter, оно стало вирусным и было показано по японскому телевидению.
Однако сориентировать Cas9, чтобы она искала конкретную уникальную последовательность в геноме человека, – это в миллионы раз сложнее, чем разрезать вирусную ДНК. Когда комплекс Cas9 входит в чужеродное пространство клеточного ядра, она сталкивается с лабиринтом ДНК – двадцатью тремя парами хромосом, шестью миллиардами букв ДНК (сравним со стандартным геномом фага, состоящим всего из нескольких тысяч оснований). Попадая в ядро, каждая молекула Cas9 обыскивает плотно упакованные спирали ДНК, чтобы найти последовательности PAM, которые встречаются в среднем один