Cas9 и Cas других видов бактерий, чтобы расширить их предпочтения в распознавании короткой последовательности PAM.
Если у бактерий настолько эффективна система безопасности, было бы резонно задаться вопросом: почему вирусы не вымерли? Вирусы незаметно развили множество обходных механизмов – группу белков, которые способны нейтрализовать нуклеазы Cas, известные как белки анти-CRISPR. Вирусы и бактерии подобны хищникам и их жертвам, вовлеченным в бесконечную борьбу, которая продолжается сотни миллионов лет[81]. CRISPR обнаружен в 46 % бактериальных геномов и почти во всех геномах архей, но, что удивительно, совсем не встречается в геномах высших организмов. Хотя на сегодняшний день Cas9 чаще всего используется совместно с CRISPR, являясь предметом ожесточенных патентных споров, о которых я расскажу позже, этот фермент представляет собой лишь каплю в море разнообразных систем CRISPR, встречающихся в природе. Ученые прикладывают массу усилий, чтобы изучить биологическое разнообразие на Земле, открыть новые белки семейства Cas с новыми функциями и расширить набор инструментов CRISPR[82].
После того как исследователь определил последовательность гена, на которую он хочет воздействовать, он может перейти на любое количество веб-сайтов, ввести желаемый генетический текст и заказать индивидуально подобранную короткую последовательность направляющей РНК. Если CRISPR – это молекулярная система работы с текстами, то направляющая РНК действует как функция CTRL + F, выявляющая интересующие последовательности генов. Работа Cas9 подобна нажатию клавиш CTRL + X. Однако редактирование генома – это не просто наведение курсора для выделения и удаления опечатки. Речь идет о том, чтобы решить, что будет дальше и как этим управлять, как исправить опечатку.
Разрезание ДНК при помощи CRISPR. 1. Сканирование: нуклеаза Cas9 связывается с направляющей РНК, образуя рибонуклеопротеидный комплекс. Направляющая состоит из крРНК и трансактивирующей крРНК. Комплекс Cas9 сканирует ДНК в поисках последовательности PAM, которая служит первичным сигналом для проверки совпадения последовательностей. 2. Сцепление: Cas9 связывается с ДНК и расщепляет двойную спираль, позволяя крРНК комплементарно (взаимодополняюще) присоединиться к одной нити ДНК. 3. Разрезание: если ДНК и РНК полностью совпадают, Cas9 претерпевает конформационное изменение, в результате чего обе нити ДНК разрезаются в одном и том же месте. (По материалам пункта 23 примечаний.)
Клетки обладают множеством молекулярных механизмов восстановления разрывов и других мутаций в ДНК. Если бы их не было, нас бы не было в живых. Два наиболее известных механизма называются негомологичным соединением концов (NHEJ) и гомологически направленной репарацией (HDR). NHEJ небрежно сшивает вместе разорванные концы ДНК, что часто приводит к небольшим вставкам или делециям генетического текста в месте восстановления. Это идеально подходит для исследователей, использующих CRISPR для преднамеренного нарушения функции гена путем