может использоваться без ограничений, так как в тканях млекопитающих не встречается. Если чувствительности такой системы недостаточно, то дополнительно используют антитела против пероксидазы или AP. Эти антитела связываются с антигенсвязывающим участком вторичных антител, что увеличивает чувствительность метода еще в 2 раза.
Следующий шаг на пути повышения чувствительности метода – иммуноокрашивание с использованием биотинавидинового комплекса. Биотин – это стойкое к действию высоких температур и широкому диапазону рН соединение, которое хорошо растворяется в воде и спирте. Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. При использовании биотина немеченые первичные антитела соединяются с антигеном; меченные биотином вторичные антитела соединяются с первичными; добавляется комплекс «авидин – биотин – фермент», который присоединяется к биотину вторичных антител. Данный метод был назван ABC-методом (аббревиатура от английского avidin and biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular сomplex). Авидин может быть заменен на стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii.
В отличие от авидина стрептавидин не связывается с эндогенными лектин-подобными веществами, что позволяет резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода. Конъюгация стрептавидина непосредственно с маркерным ферментом позволяет увеличить стабильность используемых реактивов и сделать важный шаг на пути стандартизации методов ИГХ-окрашивания препаратов. Используя вторичные антитела, связанные с биотином, и комплекс «стрептавидин – маркерный фермент», можно выявить связавшиеся с детектируемым антигеном первичные антитела в два этапа. В случае, если в качестве вторичных антител используется смесь биотинилированных антител против иммуноглобулинов нескольких животных, такой реактив допустимо использовать при работе с первичными антителами различной видовой принадлежности (например, мышиными и кроличьими). Подобный подход реализован различными биотехнологическими компаниями в удобных наборах, которые широко используются в настоящее время (например, наборы LSAB2 и LSAB+ (Dako) и др.).
В последнее время большой популярностью пользуется метод выявления комплекса «антиген – антитело», подобный непрямой иммуногистохимической реакции, в которой роль вторичных антител, связанных с ферментной меткой, выполняет сложный молекулярный комплекс. Он состоит из осевой структуры, образованной небольшой молекулой полимера, к которой присоединены вторичные антитела (иммуноглобулины или их Fab-фрагменты) и маркерный фермент. Благодаря достаточно большому числу молекул фермента, находящихся в составе подобного комплекса, увеличивается чувствительность реакции. Использование вторичных реагентов, созданных на основе такой «полимерной» технологии позволяет не только повысить чувствительность метода в сравнении