фиксаторах либо хранившегося в 80 % этаноле, тепловое демаскирование следует проводить обязательно для всех типов антигенов, которые при этом не подвергаются разрушению, и использовать вторичные системы детекции высокой чувствительности.
Степень «жесткости» альдегидной фиксации и пригодность архивного материала для ИГХ-исследования удобно контролировать, используя тест-реакцию с моноклональными антителами к виметину (клон V9). Антитела клона V9 выявляют чувствительный к перефиксации эпитоп этого белка ПФ. Поскольку клетки, содержащие виментин (фибробласты, эндотелиоциты, менингоциты и др.), присутствуют в любом гистологическом объекте, за редким исключением, отрицательные результаты пробной ИГХ-реакции на виментин будут указывать на малую пригодность материала для ИГХ в целом. При обезвоживании материала не следует применять изопропанол, который делает объекты хрупкими и плохо поддающимися резке на микротоме. В качестве промежуточных сред могут быть использованы: хлороформ, петролейный эфир, ортоксилол, метилсалицилат, метилбензоат, неоптическое кедровое масло, пихтовое масло, терпинеол. Заливку можно проводить, используя парафин любых коммерческих марок, лучше известных производителей, как отечественных, так и зарубежных. При этом не следует применять парафин с высокой температурой плавления (58 – 60 °C). При заливке не рекомендуется использовать температуры выше 60 °C.
Заливка в целлоидин и целлоидин-парафин нежелательна, так как приводит к развитию неспецифической фоновой окраски в ходе выявления пероксидазы диаминобензидином. В случае необходимости применения целлоидина перед постановкой реакций его следует удалить из срезов жидкостью Никифорова (спирт-эфиром).
Изготовление срезов для ИГХ-исследования следует проводить на надежных ротационных и санных микротомах, обеспечивающих точную подачу и необходимый диапазон толщины срезов (3 – 7 мкм). Более толстые срезы могут потребовать модификации протоколов ИГХ-обработки и изменения времени демаскирования антигенов. Кроме того, толстые срезы плохо удерживаются на предметных стеклах даже при использовании специальных адгезивов. Срезы должны быть хорошо расправлены. Отсутствие складок позволяет обеспечить лучшее прилипание к предметному стеклу.
Для того чтобы избежать неспецифической фоновой реакции при наклейке срезов на предметные стекла, не следует использовать в качестве адгезивов яичный альбумин и сыворотку крови. Обычно расправленные на дистиллированной воде срезы толщиной до 5 мкм хорошо приклеиваются к ничем не обработанным предметным стеклам импортного производства (например, к стеклам фирм «Shandon» (США) и «Menzel» (Германия)). При необходимости обычные предметные стекла для улучшения прилипания срезов могут быть обработаны специальными адгезивами (см. Приложение 2).
При расправлении и сушке срезов нежелательно применять высокие температуры (выше 48 °C). Оптимальным является просушивание срезов в суховоздушном