Среди погребенных здесь – родоначальник рода Романовых Роман Юрьевич Захарьин (умер в 1543 г.), отец патриарха Филарета боярин Никита Романович Юрьев, в схиме Нифонт (умер в 1586 г.). К древней части усыпальницы относятся захоронения четырех родных братьев патриарха Филарета, трое из которых скончались в ссылках, пострадав во времена царя Бориса Годунова, а в 1607 г. были перезахоронены в Новоспасском монастыре. Один из них – боярин Михаил Никитич Романов, сын Никиты Романовича Юрьева, мученически скончавшийся в 1602 г. в Ныробской волости (Пермский край) после продолжительного содержания в яме в цепях, почитавшийся святым, к месту кончины которого совершались паломничества. Цепи боярина хранились как святыня, в настоящее время они находятся в экспозиции местного краеведческого музея.
В 1631 г. здесь была похоронена мать первого царя из новой династии Романовых урожденная Ксения Ивановна Шестова, постриженная вместе с мужем в июне 1601 г. по приказу царя Бориса Годунова и получившая при пострижении имя Марфы. В Новоспасском монастыре были похоронены сестра царя Михаила Федоровича Татьяна Федоровна, супруга боярина князя Ивана Михайловича Катырева-Ростовского, скончавшаяся 21.07.1611, братья царя: Борис (скончался 29.11.1592), Никита (скончался в 1592 г.), Лев (скончался 21.09.1597) и Иоанн Федоровичи (07.06.1599), дочь царя Михаила Федоровича царевна Ирина Михайловна, крестная мать Петра I, умершая 08.02.1679.
Помимо Романовых и их родственников в усыпальнице погребены представители древних российских фамилий – Черкасские, Васильцевы, Дашковы, Голицыны, Куракины, Новосильцовы, а также иерархи Русской православной церкви и настоятели монастыря. Среди них – исследователь и описатель христианского Востока епископ Порфирий (Успенский, умер в 1885 г.), писатель и настоятель Новоспасского монастыря епископ Петр (Екатериновский, умер в 1889 г.).
17 сентября 1995 г. в уже возрожденный монастырь из московского Кремля согласно решению, принятому на высшем государственном уровне, торжественно перенесен прах великого князя Сергея Александровича Романова (29.04.1857–04.02.1905). Останки, собранные после взрыва бомбы эсера И. П. Каляева, были захоронены в Алексеевском храме Чудова монастыря, разрушенного в 30-е гг. XX в. Могила считалась утраченной, но была обнаружена при производстве работ на территории Кремля. В 1998 г. в монастыре был установлен воссозданный крест-памятник – точная копия креста, выполненного по проекту русского живописца В. М. Васнецова и находившегося в Кремле на месте убийства великого князя, но уничтоженного в 1918 г.
В усыпальнице теперь находится захоронение известной московской инокини Досифеи, руководство монастыря ассоциирует ее с тайной дочерью императрицы Елизаветы Петровны. Проведя практически всю жизнь в монастыре, инокиня Досифея скончалась в 1810 г.