z użyciem komercyjnie dostępnych gotowych testów diagnostycznych pozwalających na odczyty manualne lub automatyczne. Metodą łączącą zasadę dyfuzji i gradientu rozcieńczeń jest tzw. Etest – na podłoże agarowe nakłada się paski nasączone antybiotykiem o różnych stężeniach, co pozwala na bezpośredni odczyt MIC. Krajowy Ośrodek Referencyjny dla Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) na podstawie rekomendacji EUCAST ustala graniczne wartości punktów odcięcia MIC i określenia kategorii lekowrażliwości dla poszczególnych grup leków. W celu oceny profilu oporności na antybiotyki stosuje się metody kilku krążków, podłoża chromogenne czy metody molekularne, pośrednio pozwalające na identyfikację sekwencji genetycznej odpowiadającej genom lekooporności, co szczegółowo opisano w dalszej części rozdziału.
7.2.3. Hodowle wirusowe
Hodowle wirusowe pozwalają na identyfikację patogenu poprzez stymulację jego replikacji, choć są często technicznie skomplikowane, drogie i czasochłonne. Próbki inokuluje się na podłożach linii komórkowych z identyfikacją efektu cytopatycznego (zespołu zmian degeneracyjnych) w odpowiedzi na zakażenie wirusowe. Czas do wystąpienia efektu cytopatycznego i jego charakter pozwalają na wstępną identyfikację patogenu, do identyfikacji ostatecznej używana jest immunofluorescencja. Hodowle wirusów, m.in. herpeswirusów, zostały wyparte przez molekularne metody detekcji. Obecnie wykorzystywane są głównie w przypadku podejrzenia zakażenia HIV u dzieci otrzymujących profilaktykę lekami antyretrowirusowymi. Badanie pozwala na potwierdzenie lub wykluczenia aktywnego zakażenia w warunkach zahamowanej lekami replikacji tego wirusa w surowicy krwi. Hodowle wirusowe są również standardową techniką badawczą w analizach naukowych.
7.3. Diagnostyka immunologiczna
7.3.1. Immunofluorescencja
Barwienie immunofluorescencyjne bezpośrednie wykorzystuje specyficzne przeciwciała powiązane z fluorescencyjnym barwnikiem dla wykrywania mikroorganizmów lub ich cząstek strukturalnych. Wizualizacji dokonuje się najczęściej po oświetleniu próbki promieniowaniem UV. Immunofluorescencja pośrednia jest oparta na technice związanej z użyciem co najmniej 2 przeciwciał, z których pierwsze, nie skoniugowane z fluorochromem, specyficznie łączy się z wykrywanym antygenem, a następnie drugie niespecyficzne poliklonalne przeciwciała emitujące i wzmacniające sygnał fluorescencyjny łączą się z przeciwciałem specyficznym.
Immunofluorescencje pośrednia i bezpośrednia znajdują zastosowanie w wykrywaniu bakterii powolnie rosnących. Immunodiagnostyka jest również stosowana w wirusologii w celu bezpośredniej identyfikacji antygenów wirusowych za pomocą przeciwciał barwionych fluorochromami (DFA). Testów DFA używa się do identyfikacji wirusów Herpes w zmianach tkankowych, a także do typowania wirusów związanych z zakażeniami górnych dróg oddechowych (grypa, paragrypa, adenowirusy, RSV, metapneumowirusy).
7.3.2. Testy aglutynacyjne
Aglutynacja wykorzystuje reakcję antygen-przeciwciało dla zlepiania cząstek antygenowych przy użyciu krwinek czerwonych (hemaglutynacja), kulek lateksowych (tzw. test lateksowy), żelatyny czy syntetycznych mikrokulek opłaszczonych przeciwciałami. Testy aglutynacyjne są względnie tanie i stosowane do szybkiej identyfikacji antygenu z różnych materiałów biologicznych (surowica krwi, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, kał), choć ich ograniczeniem jest niska czułość. Należy zwrócić uwagę, że w przypadku nadmiaru antygenu może dojść do reakcji fałszywie ujemnych (efekt prozone), gdy antygen wiąże wszystkie miejsca receptorowe nie pozostawiając możliwości zlepiania zależnej od przeciwciał. Reakcje fałszywie ujemne weryfikuje się poprzez odpowiednie rozcieńczenie prób. Przykłady znanych odczynów aglutynacyjnych to odczyn Widala w durze brzusznym i rzekomym (paradurze), odczyn Weila-Felixa w durze plamistym oraz odczyn Wrighta w brucelozie.
7.3.3. Diagnostyka serologiczna
Testy serologiczne pozwalają na określenie odpowiedzi przeciwciał odzwierciedlającej albo przebytą infekcję, albo efekt immunizacji. Stanowią też parametr pośredni potwierdzający aktualnie trwające zakażenie. Testy serologiczne pozwalają na określenie obecności przeciwciał w klasach IgM, IgG i czasami IgA. Niektóre metodologie badań serologicznych łączą wykrywanie antygenu i przeciwciał (np. testy IV generacji HIV, skojarzone wykrywanie przeciwciał anty-HIV-1/2 i antygenu p24).
W celu oceny zmiany miana przeciwciał konieczne jest wykonanie oznaczeń ze sparowanych surowic krwi pobranych w odstępach co najmniej 14-dniowych w przypadku chorób o przebiegu ostrym oraz w odstępach dłuższych (3–12 miesięcy) dla oceny dynamiki wygaszania przeciwciał po zakażeniu. Typowo serokonwersja z wyniku ujemnego IgM i IgG do dodatniego lub 4-krotny wzrost całkowitego miana przeciwciał stanowi odzwierciedlenie aktywnego lub niedawno przebytego zakażenia. Niekiedy ewolucja jakościowa przeciwciał skierowanych przeciwko różnym antygenom wirusowym odzwierciedla fazę zakażenia (wykrycie przeciwciał dla antygenu wczesnego i/lub kapsydowego w aktywnym zakażeniu EBV, obecność przeciwciał wiążących się z antygenem jądrowym w zakażeniach latentnych).
Testy immunoenzymatyczne
Jedną z najczęściej stosowanych technik w badaniach serologicznych jest grupa testów immunoenzymatycznych (EIA), które pozwalają na wykrycie reakcji antygen-przeciwciała poprzez jej enzymatyczne powiązanie z substratem umożliwiającym odczyt za pomocą kolorymetrii, fluorymetrii lub chemiluminescencji. Testy EIA pozwalają na wykrywanie antygenów i przeciwciał. Ich czas wykonania jest zazwyczaj krótki (2–3 godziny, a czasami mniej).
Jedną z najszerzej stosowanych modyfikacji metody EIA jest test immunoenzymosorbcyjny ELISA, w którym jedno z przeciwciał jest związane (unieruchamiane), co pozwala na wiązanie wykrywanego białka z następową reakcją barwną. Istnieje wiele modyfikacji testu ELISA, które podobnie jak testy EIA mogą być stosowane zarówno do wykrywania przeciwciał, jak i antygenów (lub obu równocześnie). Wyniki fałszywie ujemne zdarzają się w przypadku obecności znacznego nadmiaru antygenu (tzw. efekt haka), a wyniki fałszywie dodatnie wynikają z obecności przeciwciał heterofilnych, czynnika reumatoidalnego lub innych substancji interferujących.
Technik immunoenzymatycznych używa się do identyfikacji bardzo szerokiego wachlarza patogenów – bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, atypowych, grzybów, pierwotniaków, pasożytów czy wirusów. Materiałem badanym mogą być próbki surowicy krwi, moczu, kału, płynu mózgowo-rdzeniowego, plwocina, popłuczyny oskrzelowo-płucne, wydzielina pochwowa i inne. Testy te mogą również być modyfikacją testów aglutynacyjnych. Pozwalają wtedy na wykrycie fragmentów ściany komórkowej bakterii lub lipopolisacharydów. Ich czułość jest wyższa niż testów aglutynacji, choć często nie pozwala na oznaczenie ilości antygenu obecnego w próbce. Antygenowe testy EIA są stosowane do typowania zakażeń Salmonella i Shigella oraz wykrywania toksyn A i B Clostridium difficile. Odmianami testów immunoenzymatycznych, które zwiększają czułość reakcji, są chemiluminescencja pośrednia (zmiany emisji świetlnej mogą być wykrywane już przy bardzo niewielkich natężeniach reakcji) i testy radioimmunologiczne (stosowane rzadko ze względu na konieczność spełnienia zasad bezpieczeństwa radiologicznego).
Szybkie testy diagnostyczne
Tak zwane szybkie testy diagnostyczne (POCT) są przeznaczone do wstępnej diagnostyki zakażeń bakteryjnych i wirusowych. Stanowią modyfikację testów immunologicznych (immunoenzymatycznych, immunochromatograficznych), często na podstawie prostych testów kasetowych, lub wykorzystują metody biochemiczne. Mogą być wykonane nawet w domu pacjenta i uprawdopodabniają rozpoznanie choroby.
Wskazaniem do wykonania testu są objawy kliniczne sugerujące zakażenie, choć należy podkreślić, że szybkie testy diagnostyczne mogą charakteryzować się obniżoną czułością lub swoistością oraz wydłużonym oknem diagnostycznym, więc ich interpretacja powinna być ostrożna.
Praktyczne