PCR (nested PCR), którą stosuje się w celu poprawy czułości i swoistości. Wykorzystuje się w niej 2 zestawy starterów (para zewnętrzna otaczająca parę wewnętrzną), co pozwala na zmniejszenie ryzyka kontaminacji.
PCR multipleksowy zawiera wiele komplementarnych sond barwionych różnymi fluorochromami. Pozwala więc na jednoczesne wykrywanie wielu różnych patogenów. Metoda rozwijana jest dla diagnostyki molekularnej patogenów związanych z zakażeniami górnych dróg oddechowych i neuroinfekcjami oraz stosowana w szybkiej diagnostyce sepsy.
Odmianą PCR jest również technika LIPA (line probe assay) polegająca na wiązaniu amplifikowanego kwasu nukleinowego na matrycy nitrocelulozowej. Wykorzystuje się ją do określenia genotypu HBV i HCV.
Technika PCR i jej odmiany są stosowane do wykrywania szerokiego wachlarza patogenów, od bakterii, włączając trudno rosnące i wewnątrzkomórkowe, przez wirusy, również nowo pojawiające się, jak wirusy gorączek krwotocznych (Ebola czy Zika), do grzybów i pasożytów (malaria). Badania PCR znalazły również zastosowanie w wykrywaniu genów i plazmidów lekooporności bakterii. Mają też szerokie zastosowania naukowe.
Techniki molekularne do wykrywania i monitoringu liczby patogenów są cały czas rozwijane. Pojawiają się liczne modyfikacje istniejących technik łączące amplifikację z hybrydyzacją i ligacją.
7.4.3. Sekwencjonowanie i sekwencjonowanie nowej generacji
Sekwencjonowanie i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to techniki molekularne pozwalające na identyfikację patogenów dotychczas nieznanych, określenie lekowrażliwości wirusów obecnych w surowicy krwi i w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz analizę ich zmienności pomiędzy kompartmentami surowica krwi/płyn m.-r. (aktualnie dobrze opracowane technicznie dla HIV-1) a także na śledzenie rozprzestrzeniania się mikroorganizmów metodami filogenetycznymi.
Różnica pomiędzy techniką sekwencjonowania tak zwaną metodą Sangera (klasyczna) i technikami sekwencjonowania nowej generacji (głębokie sekwencjonowanie – deep sequencing) polega na tym, że tylko techniki NGS pozwalają na określenie ilościowe proporcji wariantów z mutacją lub substytucją (np. jaki procent populacji wirusowych w danej próbce ma mutacje lekooporności).
W diagnostyce molekularnej w chorobach zakaźnych techniki sekwencjonowania są stosowane rutynowo do oznaczania genotypowej lekooporności HIV i HCV. Mogą być również wykorzystywane do oznaczania wariantów lekoopornych w innych zakażeniach wirusowych, np. HSV-1 czy CMV. W celu stworzenia algorytmów służących do przełożenia obecności mutacji na fenotyp lekooporności używano testów fenotypowych (hamowanie replikacji wirusowej w środowisku leku) z następowym oznaczaniem zmienności genetycznej badanego wirusa. Takie analizy pozwoliły na zdefiniowanie listy mutacji związanych z lekoopornością i opracowanie algorytmów interpretacyjnych umożliwiających powiązanie wykrytych mutacji z odpornością na dany lek in vivo. Wykorzystuje się różne bazy umożliwiające interpretację danych genotypowych zawierających informacje dotyczące lekooporności, np. Los Alamos National Laboratories (http://hiv-web.lani.gov), Stanford (http://hivdb.stanford.edu), Vircolab (http://www.vircolab.com) czy geno2pheno. Bazy te są stale uaktualniane dla nowych związków między mutacjami a lekoopornością fenotypową, na podstawie których doskonalona jest interpretacja wyników genotypowania.
Opierając się na sekwencjonowaniu można także przewidywać tropizm HIV-1 (powinowactwo do koreceptora CCR5 lub CXCR4). W tym miejscu należy przypomnieć o dwóch kluczowych z punktu widzenia selekcji mutacji oporności definicjach – barierze genetycznej i jej związku z presją selekcyjnej ze strony leku oraz aktywności replikacyjnej (fitness). Bariera genetyczna dla leku jest definiowana jako selekcja mutacji lekooporności wystarczająca do przełamania działania leku. Można również powiedzieć, że bariera genetyczna to próg, od którego mutacje nabierają znaczenia klinicznego oraz szybkość (łatwość) ich selekcji pod wpływem leku lub klasy leków. Próg ten zależy od wielu czynników, w tym liczby mutacji koniecznych do utraty lekowrażliwości i ich kombinacji (niektóre mutacje mogą mieć silniejszy wpływ na zmianę stężeń hamujących niż inne). Nie ma więc prostego algorytmu określającego związek pomiędzy barierą genetyczną a liczbą mutacji. Typowo wyższa bariera genetyczna oznacza konieczność akumulacji wielu mutacji, włączając tak zwane mutacje kluczowe (major mutations) oraz mutacje dodatkowe (optymalizujące replikację wirusa w środowisku leku). Lekooporność na preparaty o niższej barierze genetycznej często rozwija się szybciej i wymaga mniejszej liczby mutacji.
Techniki sekwencjonowania są również stosowane do odkrywania nowych organizmów. Do identyfikacji rzadkich bakterii, w tym wolno rosnących lub niemożliwych do hodowli mikrobiologicznej, można zastosować skojarzoną technikę amplifikacji sekwencji kodującej jednostkę 16S rybosomalnego DNA z sekwencjonowaniem. Na podstawie zmienności tej sekwencji porównanej z dużą bazą danych sekwencji referencyjnych można dokonać identyfikacji nawet bardzo rzadkiego organizmu. Jest to metodologia czasochłonna i wciąż dość droga w rutynowej praktyce klinicznej, ale znajduje coraz szersze zastosowanie m.in. w identyfikacji prątków niegruźliczych.
7.4.4. Analizy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu i farmakogenetyka
Identyfikacja markerów genetycznych związanych z metabolizmem leków antywirusowych i antybiotyków opiera się głównie na wykrywaniu zmian (polimorfizmów) pojedynczego nukleotydu (SNP) – naturalnej zmienności genetycznej człowieka warunkującej poziom ekspresji danego genu. Do ich oznaczania używa się zarówno technik PCR, jak i sekwencjonowania. Ich wpływ praktyczny przekłada się na częstość występowania działań niepożądanych terapii i odpowiedź na terapię, szczególnie antywirusową. Ważnym zagadnieniem jest również badanie zmienności genetycznej gospodarza i jej wpływu na podatność i progresję zakażenia (np. HIV) czy częstość samoeliminacji zakażenia (np. HCV). Warianty genetyczne związane z modyfikacją podatności gospodarza na zakażenia mogą ograniczać replikację wirusa, opóźniać lub przyspieszać wystąpienie klinicznych objawów choroby lub całkowicie ją hamować.
Aktualnie jeden wariant, HLA B*5701 związany z nadwrażliwością na abakawir, jest oznaczany w praktyce klinicznej (pierwszy szeroko stosowany test farmakogenetyczny zaadoptowany dla praktyki klinicznej). Reakcje nadwrażliwości na abakawir (ABC-HSR) były obserwowane u około 8% osób zakażonych HIV rasy kaukaskiej po zastosowaniu leku i objawiały się wysypką, gorączką, kaszlem, dusznościami, zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi lub ogólnym osłabieniem i zostały powiązane właśnie z obecnością powyższego allelu HLA-B. Oznaczanie HLA B*5701 pozwala na znaczące obniżenie częstości reakcji nadwrażliwości po włączeniu abakawiru, z dodatnią wartością prognostyczną testu na poziomie 61,2% i ujemną wartością prognostyczną 95,5%, czułością dla ABC-HSR obserwowanych klinicznie na poziomie 44% i specyficznością 96%. Częstość występowania allelu HLA B*5701 wśród osób zakażonych HIV w Polsce wynosi 4,7%.
W praktyce stosowano również oznaczanie wariantu interleukiny 28B (interferonu lambda 3) związanego z różnicami w odpowiedzi wirusowej na leczenie HCV po terapii interferonem. W związku z wprowadzeniem terapii bezinterferonowych oznaczenie to straciło na znaczeniu.
Analizy związku wariantów genetycznych z podatnością na choroby zakaźne i skutecznością ich leczenia są prowadzone w wielu pracowniach naukowych.
7.5. Cytometria w chorobach zakaźnych
Cytometria przepływowa jest techniką analityczną pozwalającą na szybki pomiar emisji świetlnej i fluorescencji na odpowiednio wybarwianych komórkach poprzez przejścia przez promień świetlny. Technika ta przy odpowiednim oprzyrządowaniu pozwala na separację komórek i określenie ich charakterystyki. Rutynowo w chorobach zakaźnych cytometria przepływowa jest używana