z kolonizacji lub długotrwałego wydalania antygenu po zakażeniu inwazyjnym. Szybkie testy wykrywające antygeny Streptococcus agalactiae u ciężarnych mają niższą czułość w porównaniu z wymazami z pochwy/odbytu. Rozważa się również stosowanie szybkich testów wykrywających przeciwciała anty-HIV (okno diagnostyczne wynosi 3 miesiące, wymagane potwierdzenie metodami o wyższej specyficzności).
Odczyn wiązania dopełniacza
Odczyn wiązania dopełniacza pozwala na identyfikację obecności specyficznych przeciwciał w surowicy krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym poprzez wiązanie dopełniacza pochodzącego od zwierząt. Po inkubacji z określonym stężeniem dopełniacza i antygenu komplementarnego do oznaczanego przeciwciała stopień fiksacji dopełniacza pozwala na określenie miana przeciwciał, a czasem także na wykrycie określonego antygenu. Odczyn ten znalazł zastosowanie m.in. w diagnostyce zakażeń Coxiella burneti i kokcydioidomykoz.
Inne testy immunoenzymatyczne stosowane w chorobach zakaźnych
Testy oparte na metodologii western blot lub ich modyfikacje, czyli techniki immunoblottingu, techniki rekombinowanego immunoblottingu (RIBA), immunochromatografia i test liniowej precypitacji (LIA), są stosowane do wykrywania specyficznych przeciwciał z płynów biologicznych (surowicy krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, płynów surowiczych) pobranych od pacjenta. Testy wykorzystują antygeny lub ich fragmenty związane z podłożem. Charakteryzują się dobrą czułością, choć ich główną cechą jest wysoka specyficzność. Stosuje się je do potwierdzeń zakażenia po dodatnich wynikach testów przesiewowych.
Testy oparte na technikach blottingu pozwalają na identyfikację obecności przeciwciała wiążącego konkretny antygen, dlatego ich interpretacja jest dokładniejsza niż testów EIA/ELISA. Praktycznie zastosowanie znalazły m.in. w diagnostyce zakażenia HIV, boreliozy, bąblowicy czy zakażenia HCV.
Fałszywie ujemne testy western blot lub immunoblottingu mogą zdarzyć się w przypadkach hipogammaglobulinemii lub agammaglobulinemii oraz głębokiego wyniszczenia (test zależny od produkcji przeciwciał). Ograniczeniem testów immunoblottingu jest również ich jakościowy charakter – generalnie nie służą do określenia zmienności miana przeciwciał.
Technika western blot ma poza tym liczne zastosowania badawcze w celu wykrywania białek, w tym enzymów i przeciwciał, czy potwierdzania zakażeń nowo wykrytymi czynnikami.
Testy awidności
Testy awidności opisują siłę wiązania przez przeciwciała specyficznego ligandu złożonego zawierającego co najmniej 2 miejsca wiązania. W pierwszych dniach/tygodniach zakażenia, po wytworzeniu się przeciwciał klasy IgG siła wiązania antygenu jest niska i rośnie wraz z czasem trwania zakażenia. Niska awidność odzwierciedla niską siłę wiązania przeciwciał i wczesne zakażenie. Awidność dojrzewa do wysokiej przez okres około 12 tygodni. Testy awidności wykorzystuje się w tych zakażeniach, w których przeciwciała wczesne (IgM) są często eliminowane powoli, w czasie nawet do kilku lat (np. toksoplazmoza, w której opisywano przetrwałe IgM przez 8–12 lat), lub w przypadkach wątpliwych serologicznie, szczególnie u kobiet ciężarnych. Określenie awidności przeciwciał IgG pozwala uprawdopodobnić czas zakażenia z typowym różnicowaniem czasowym powyżej lub poniżej 12 tygodni. Należy zauważyć, że w pojedynczych przypadkach awidność po przebytym zakażeniu wczesnym dojrzewa wolniej. Jej ewolucja opóźnia się także w przypadku osób, które otrzymały antybiotykoterapię hamującą namnażanie patogenu odpowiedzialnego za stymulację produkcji przeciwciał.
7.4. Metody molekularne
Wykrywanie patogenów metodami molekularnymi stało się podstawą diagnostyki w chorobach zakaźnych, pozwalając na szybką i specyficzną identyfikację obecności materiału genetycznego danego patogenu i umożliwiając szybką optymalizację terapii. Metodami molekularnymi można wykryć zarówno RNA, jak i DNA, często z wykorzystaniem testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT). Diagnostyka molekularna w większości przypadków ma wąskie spektrum – służy do wykrywania pojedynczych patogenów. W związku z tym do klinicysty należy decyzja o wyborze kierunku badania. Aktualnie rozwijane są testy pozwalające wykryć i zróżnicować materiał genetyczny kilku lub kilkunastu patogenów jednocześnie (testy multipleksowe). Doskonalone są także techniki wykrywania mikroorganizmów oparte na mikrochipach, ligacji czy pirosekwencjonowaniu, choć ich zastosowanie dla konkretnych patogenów nie zostało jeszcze zoptymalizowane klinicznie.
7.4.1. Hybrydyzacja
Techniki hybrydyzacji pozwalają na wykrycie obecności materiału genetycznego mikroorganizmu w próbkach tkankowych, w tym w utrwalonych preparatach histologicznych czy cytologicznych. Hybrydyzacja in situ (z miejscowym wykryciem materiału genetycznego) pozwala przykładowo na wykrycie CMV, HPV czy EBV. Techniki hybrydyzacji stosowane są również do wykrywania paciorkowców grupy A i zakażeń przenoszonych drogą płciową (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis). Podstawą metodologii jest przyłączanie (hybrydyzacja) specyficznej sondy molekularnej do RNA/DNA poszukiwanego mikroorganizmu z następową detekcją sygnału metodą radiometryczną, kolorymetryczną, fluorymetryczną lub chemiluminescencyjną. Techniki hybrydyzacji pozwalają na bezpośrednie wykrycie danego patogenu, bez konieczności amplifikacji jego kwasów nukleinowych.
7.4.2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
Reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na amplifikację sygnału wykrywającego obecność kwasów nukleinowych (DNA i RNA) z zastosowaniem specyficznych starterów w celu uzyskania widocznego produktu reakcji lub fluorescencji wyraźnie różniącej się od tła. Technicznie do wykonania reakcji konieczne jest wielokrotne szybkie podgrzewanie i ochładzanie próbki badanego materiału genetycznego z zastosowaniem polimerazy, co pozwala na separację nici kwasów nukleinowych, przyłączanie i wydłużanie starterów oraz wykrywanie sygnału (jeśli stosowano sondę molekularną). Testy PCR są wysoko specyficzne, a ich czułość zależy od obecności materiału genetycznego mikroorganizmu w badanej próbce. W związku z tym, że opierają się na specyficznych starterach/sondach, ich czułość zmniejsza się w przypadku rekombinacji lub mutacji mikroorganizmów (może dojść do obniżenia siły wiązania starterów/sond i reakcji fałszywie ujemnych), a także w sytuacji zakażenia innym genotypem lub gatunkiem patogenu. Techniki PCR są również podatne na kontaminację, dlatego powinny być wykonywane albo w systemach zamkniętych, albo w specjalnie przygotowanych pomieszczeniach/komorach minimalizujących ryzyko przeniesienia materiału genetycznego pomiędzy próbkami, w laboratoriach o odpowiedniej kontroli jakości. Ograniczenia metod opartych na PCR są ponadto związane z możliwością wykrycia patogenów o wyłącznie znanej sekwencji genetycznej. Należy pamiętać, że są one doskonałymi testami potwierdzenia, ale nie jednoznacznymi testami wykluczenia.
Zalety techniki PCR to jej szybkość (często wystarczy kilka godzin do potwierdzenia zakażenia), możliwość zaprojektowania starterów/sond do wykrywania nowo wykrytych patogenów oraz czynników odpowiedzialnych za choroby wysoce zakaźne, a także zmniejszający się koszt diagnostyki.
Materiałami diagnostycznymi mogą być krew pełna, surowica krwi, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny surowicze, kał, mocz, tkanka i inne.
Istnieje kilka odmian PCR i połączeń tej metody z innymi technikami. Do wykrywania RNA (np. wirusy) konieczne jest zastosowanie odwrotnej transkrypcji (RT-PCR). Techniki tej nie należy mylić z coraz popularniejszą metodologią real-time PCR, czyli wykrywania produktu reakcji w czasie rzeczywistym. W technice real-time PCR mieszanina reakcyjna obok starterów zawiera także specyficzne sondy molekularne będące podstawą wykrywania materiału genetycznego danego mikroorganizmu. W trakcie reakcji dochodzi do wzrostu intensywności sygnału fluorescencyjnego, co odzwierciedla